ВходКлеточные культуры для чего. Клеточные культуры. Основные принципы культивирования
Клеточные культуры — это генетически однородные популяции клеток, растущих в постоянных условиях окружающей среды. Это могут быть штаммы нормальных клеток человека, животных, растений или тканей злокачественных опухолей.
Условия культивирования
Клетки обычно помещают в стеклянные сосуды, отсюда и исследования получили название изучение in vitro (от лат. In — в, vitro — стекло), хотя теперь чаще культуры выращивают в пластмассовых сосудах. Выделенные из тканей клетки инкубируют при температуре 38 ° C 39 ° C (для клеток животного и человеческого организмов) и при 22 ° C 28 ° C (для растительных клеток) в питательной среде соответствующего состава. Клетки тогда растут в виде суспензии или монослоя. Суспензионная культура — это выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде с использованием аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание. Характерной особенностью суспензионных культур является их морфологическая и биохимическая гетерогенность. Клеточная популяция содержит клетки, которые отличаются по размеру и форме.
Применение
Применение в цитологии
В цитологии данный метод удобен тем, что клетки в культуре легко доступны для различных биохимических манипуляций. При работе с ними радиоактивные вещества, яды, гормоны и др. могут быть введены в нужной концентрации в течение требуемого времени. Количество этих веществ может быть на порядок меньше, чем при эксперименте на животных. Исчезает угроза того, что вещество будет Метаболизированный печенью, экскретироваться почками или отложится в мышцах. Это обеспечивает получение реальных значений скорости действия вещества на клетку или ее усвоения клеткой.
Для исследования живых растительных клеток используют культуру изолированных протопластов. Изолированные протопласты можно определить как «голые» клетки растений, поскольку клеточная стенка удаляется механическим или ферментативным способом. Система изолированных протопластов дает возможность вести селекцию на клеточном уровне, работать в малом объеме с большим количеством индивидуальных клеток, получать новые формы растений путем прямого переноса генов, получать соматические гибриды между удаленными в систематическом отношении видами. Поскольку в изолированных протопластах сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они являются удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.
Применение в вирусологии
В вирусологии культуры клеток используются очень широко, поскольку с ними сравнительно легко работать в лаборатории, в отличие от других методов — выращивание вирусов на куриных эмбрионах или в организме живых животных. Кроме того, на монослое клеточной культуры можно хорошо изучить цитопатическое действие вирусов, по образованию внутри- клеточных включений, бляшек, в реакциях гемадсорбции и гемагглютинации и по цветовой пробоя. При работе с культурами клеток существенные результаты могут быть получены при работе с небольшим количеством культур. Эксперименты, которые требуют для подтверждения того или иного факта сотни или тысячи лабораторных животных могут быть с равным статистической достоверностью поставлены на таком же количестве культур клеток. Таким образом при лаборатории не надо держать виварий и отсутствуют этические аспекты обращения с больными животными.
Также изучается трансформация клеток вирусами, механизм которой подобен механизму возникновения злокачественных опухолей.
Применение в фармакологии
Культуры клеток широко применяются для тестирования действия веществ, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов. Несмотря на то, что результаты, полученные на культурах клеток нельзя экстраполировать на весь организм, не вызывает сомнения, что если то или иное вещество нарушает деятельность клеток из нескольких разных линиях культур, то необходимо ожидать негативного эффекта и при введении этого вещества в организм.
Применение в биотехнологии
Специфические культуры клеток является ценным источником гормонов и других биологически активных веществ. Уже сейчас они применяются для производства противовирусного белка интерферона.
Применение в генетике
В генетике способность клеток к росту в культуре используется в следующих направлениях:
- Клонирование
- Хранение клеток
- Получение мутантных клеток и работа с ними
Типы культур клеток
1. Первично-трипсинизовани — получают из измельченных тканей человека и животных путем их обработки трипсином или другими ферментами. Выдерживают лишь 5-10 делений (пассажей).
2. перевиваемых — клетки, которые приобрели способность к безграничному размножению, поскольку являются производными опухолей человека и животных.
3. Напивперещеплювани (диплоидные) — могут выдерживать до 100 пассажей, сохраняя при этом исходный диплоидный набор хромосом.
Наиболее распространенные линии клеток
| Линия клеток | Расшифровка сокращения | Организм | Ткань | Морфология | Примечания и ссылки | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 293-T | человек | почка (эмбриональная) | Производная от HEK-293 ECACC | |||
| 3T3 cells | «3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells» | мышь | эмбриональные фибробласты | Известна также как NIH 3T3 ECACC | ||
| 721 | человек | меланома | ||||
| 9L | крыса | глиобластома | ||||
| A2780 | человек | яичник | рак яичника | ECACC | ||
| A2780ADR | человек | яичник | производное A2780 с резистентностью к адриамицин | ECACC | ||
| A2780cis | человек | яичник | производное A2780 с резистентностью к цисплатина | ECACC | ||
| A172 | человек | глиобластома | злокачественная глиома | ECACC | ||
| A431 | человек | кожаный эпителий | плоскоклеточная карцинома | ECACCCell Line Data Base | ||
| A-549 | человек | карцинома легких | эпителий | DSMZECACC | ||
| B35 | крыса | нейробластома | ATCC | |||
| BCP-1 | человек | периферические лейкоциты | HIV + лимфома | ATCC | ||
| BEAS-2B | bronchial epithelium + adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12SV40) | человек | легкие | эпителий | ATCC | |
| bEnd.3 | brain endothelial | мышь | кора головного мозга | эндотелий | ATCC | |
| BHK-21 | «Baby Hamster Kidney» | хомяк | почка | фибробласты | ECACCOlympus | |
| BR 293 | человек | молочная железа | рак | |||
| BxPC3 | Biopsy xenograph of pancreatic carcinoma line 3 | человек | панкреатическая аденокарцинома | эпителий | ATCC | |
| C3H-10T1 / 2 | мышь | эмбриональные мезенхимальные клетки | ECACC | |||
| C6 / 36 | комар | ткани личинки | ECACC | |||
| CHO | Chinese hamster ovary | Cricetulus griseus | яичник | эпителий | ECACCICLC | |
| COR-L23 | человек | легкие | ECACC | |||
| COR-L23 / CPR | человек | легкие | ECACC | |||
| COR-L23 / 5010 | человек | легкие | ECACC | |||
| COR-L23 / R23 | человек | легкие | эпителий | ECACC | ||
| COS-7 | Cercopithecus aethiops, origin-defective SV-40 | обезьяна Cercopithecus aethiops | почка | фибробласты | ECACCATCC | |
| CML T1 | Chronic Myelod Leukaemia T-lymphocyte 1 | человек | хроническая миелоидна лейкемия | T-клеточная лейкемия | Blood | |
| CMT | canine mammary tumor | собака | молочная железа | эпителий | ||
| D17 | собака | остеосаркома | ECACC | |||
| DH82 | собака | гистиоцитоз | моноциты / макрофаги | ECACC | ||
| DU145 | человек | карцинома | простата | |||
| DuCaP | Dura mater Cancer of the Prostate | человек | эпителий | 11317521 | ||
| EL4 | мышь | T-клеточная лейкемия | ECACC | |||
| EMT6 / AR1 | мышь | молочная железа | эпителий | ECACC | ||
| EMT6 / AR10.0 | мышь | молочная железа | эпителий | ECACC | ||
| FM3 | человек | метастазы в лимфатический узел | меланома | |||
| H1299 | человек | легкие | рак | |||
| H69 | человек | легкие | ECACC | |||
| HB54 | Гибридома | Гибридома | секретирует L243 mAb (против HLA-DR) | Human Immunology | ||
| HB55 | Гибридома | Гибридома | секретирует MA2.1 mAb (против HLA-A2 и HLA-B17) | Journal of Immunology | ||
| HCA2 | человек | фибробласты | Journal of General Virology | |||
| HEK-293 | human embryonic kidney | человек | почка (эмбриональная) | эпителий | ATCC | |
| HeLa | Henrietta Lacks | человек | рак шейки матки | эпителий | DSMZECACC | |
| Hepa1c1c7 | clone 7 of clone 1 hepatoma line 1 | мышь | гепатома | эпителий | ECACC | |
| HL-60 | human leukemia | человек | миелобласты | клетки крови | ECACCDSMZ | |
| HMEC | human mammary epithelial cell | человек | эпителий | ECACC | ||
| HT-29 | человек | эпителий толстого кишечника | аденокарцинома | ECACC
Cell Line Data Base |
||
| Jurkat | человек | T-клеточная лейкемия | белые клетки крови | ECACC | ||
| JY | человек | лимфобласты | В-клетки, имортализовани EBV | |||
| K562 | человек | лимфобласты | ECACC | |||
| Ku812 | человек | лимфобласты | эритролейкемию | ECACC | ||
| KCL22 | человек | лимфобласты | хронической миелоидной лейкемией | |||
| KYO1 | Kyoto 1 | человек | лимфобласты | хронической миелоидной лейкемией | DSMZ | |
| LNCap | Lymph node Cancer of the Prostate | человек | аденокарцинома простаты | эпителий | ECACCATCC | |
| Ma-Mel 1, 2, 3 … .48 | человек | линии клеток меланомы | ||||
| MC-38 | мышь | аденокарцинома | ||||
| MCF-7 | Michigan Cancer Foundation-7 | человек | молочная железа | инвазивная карцинома протоков молочной железы | ER +, PR + | |
| MCF-10A | Michigan Cancer Foundation | человек | молочная железа | эпителий | ATCC | |
| MDA-MB-231 | человек | молочная железа | рак | ECACC | ||
| MDA-MB-468 | MD Anderson — Metastatic Breast | человек | молочная железа | рак | ECACC | |
| MDA-MB-435 | MD Anderson — Metastatic Breast | человек | молочная железа | меланома или карцинома (единое мнение отсутствует) | Cambridge Pathology ECACC | |
| MDCK II | Madin Darby canine kidney | собака | почка | эпителий | ECACC ATCC | |
| MOR / 0.2R | человек | легкие | ECACC | |||
| NCI-H69 / CPR | человек | легкие | ECACC | |||
| NCI-H69 / LX10 | человек | легкие | ECACC | |||
| NCI-H69 / LX20 | человек | легкие | ECACC | |||
| NCI-H69 / LX4 | человек | легкие | ECACC | |||
| NIH-3T3 | National Institutes of Health, 3-day transfer, inoculum 3 x 10 май cells | мышь | эмбрион | фибробласты | ECACCATCC | |
| NALM-1 | периферическая кровь | хронической миелоидной лейкемией | Cancer Genetics and Cytogenetics | |||
| NW-145 | меланома | ESTDAB | ||||
| OPCN / OPCT | Onyvax Prostate Cancer …. | линии клеток рака простаты | Asterand | |||
| Peer | человек | T-клеточная лейкемия | DSMZ | |||
| PNT-1A / PNT 2 | линии клеток рака простаты | ECACC | ||||
| RenCa | Renal Carcinoma | мышь | карцинома почки | |||
| RIN-5F | мышь | поджелудочная железа | ||||
| RMA / RMAS | мышь | T-клеточный рак | ||||
| Saos-2 | человек | остеосаркома | ECACC | |||
| Sf-9 | Spodoptera frugiperda | бабочка Spodoptera frugiperda | яичник | DSMZECACC | ||
| SkBr3 | человек | карцинома молочной железы | ||||
| T2 | человек | Гибридома В-клеток и Т-клеточной лейкемии | DSMZ | |||
| T-47D | человек | молочная железа | карцинома протоков | |||
| T84 | человек | карцинома толстого кишечника / метастазы в легкие | эпителий | ECACCATCC | ||
| THP1 | человек | моноциты | острый миелоидный лейкоз | ECACC | ||
| U373 | человек | глиобластома-астроцитома | эпителий | |||
| U87 | человек | глиобластома-астроцитома | эпителий | Abcam | ||
| U937 | человек | лейкемическая моноцитарная лимфома | ECACC | |||
| VCaP | Vertebra Prostate Cancer | человек | метастатический рак простаты | эпителий | ECACC ATCC | |
| Vero | "Vera Reno "/" Vero" ("истина") | африканская зеленая мартышка | эпителий почки | ECACC | ||
| WM39 | человек | кожа | первичная меланома | |||
| WT-49 | человек | лимфобласты | ||||
| X63 | мышь | меланома | ||||
| YAC-1 | мышь | лимфома | Cell Line Data Base ECACC | |||
| YAR | человек | B-лимфоциты | трансформированные EBV | Human Immunology |
I. Культуры клеток
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.
По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.
Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.
Источником перевиваемых линий бывают первичные клеточные культуры (к примеру, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными.
Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека.
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на базе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.
I. Культуры клеток - понятие и виды. Классификация и особенности категории "I. Культуры клеток" 2017, 2018.
II. Беспроводные средства связи I. Проводные средства связи Ø Городскую телефонную связь Ø Прямая телефонная связь (селекторная)Ø Радиотелефонная связь («Алтай») Ø Индуктивная связь (ЭКВ связь «Дистон», «Нальмэс») Ø... .
Таблица 15 Таблица 14 Таблица 13 Таблица 12 Таблица 11 Дороги Движения по сложным процентам в различные годы эксплуатации Величины коэффициентов m, K0, K0m при росте интенсивности Таблица... .
Занятие №5 Тормозная система Тема №8 Механизмы управления По устройству автомобильной техники Проведения группового занятия План – конспект Преподаватель цикла ПОПОН подполковник Федотов С.А. "____"... .
Рис.5.9. О подрезании зубьев колёс. Рассмотрим, как связан коэффициент сдвига x рейки с числом зубьев, которое может быть нарезано рейкой на колесе. Пусть рейка установлена в положении 1(рис.5.9.). В этом случае прямая головок рейки пересечёт линию зацепления N-N в т. и... .
Los verbos irregulares Идти - ir Есть - comer Спать - dormir Хотеть - querer Я Иду Ем Сплю Хочу Ты Идёшь Ешь Спишь Хочешь Он, она Идёт Ест Спит Хочет Мы Идём Едим Спим Хотим Вы Идёте Едите Спите Хотите Они Идут...
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные), полуперевиваемые (диплоидные), перевиваемые, трансфецированные.
По происхождению они подразделяются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.
Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в специальной питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Полуперевиваемые (диплоидные ) культуры клеток - клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ - из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС - из почек эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки и др.), отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в клетках таких свойств, называют трансформацией , а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными .
Другой источник перевиваемых клеточных линий - злокачественные новообразования . В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Получены и наиболее широко в вирусологической практике применяются следующие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Hep-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака легкого в костный мозг; RH - из опухоли почки человека.
Трансфецированные культуры клеток. Разработаны экспериментальные линии культур клеток методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных антигенов. Такие культуры клеток экспрессируют поверхностный белок определенного вируса (HBs-антиген, gp120 и др.) на мембране клеток культуры. Такие культуры клеток используются с целью изучения иммунологических механизмов патогенеза вирусных инфекций, разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.
Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды . По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит. С целью предотвращения возможного роста микроорганизмов в питательные среды вносят антибиотики.
Клеточная культура
Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.
История
В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор , содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней . Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток.
Основные принципы культивирования
Выделение клеток
Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей. Клетки, взятые непосредственно от объекта, называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки подвергаются процессу старения и прекращают делиться, но жизнеспособность не утрачивают. Существуют «бессмертные» линии клеток, способные размножаться бесконечно. Эта способность является результатом случайной мутации , либо приобретена искусственно, с помощью подавления гена теломеразы .
Выращивание клеток
Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре и в специальной газовой среде в инкубаторе клеточных культур . Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др . Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего получают из крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингридиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Клетки можно выращивать в суспензии , либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно измененных таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности, это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения сцепных свойств, и для стимулирования роста и дифференцирования. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяется органотипический тип культуры клеток, который представляет собой трехмерную среду, в отличие от от обычной лабораторной посуды. Этот система культивирования физически и биохимически наиболее схожа с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии).
Перекрестное загрязнение клеточных линий
При работе с клеточными культурами ученые могут столкнуться с проблемой перекрестного загрязнения. Судя по результатам исследований, можно предположить, что в 15-20 % случаев клетки, используемые в экспериментах были испорчены, или были загрязнены клетками других клеточных линий .
Особенности выращивания клеток
При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы:
- Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
- Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
- Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
- По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .
Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).
Линии клеток человека
Одна из самых ранних культур клеток человека, полученная от Генриетты Лакс, которая умерла от рака шейки матки. Культура клеток ядра окрашены в синий цвет.
Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия .
Линия клеток «Гибридома»
Продукты биотехнологии
Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .
Тканевые культуры
Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .
Вакцины
С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против
1966 г.).
Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведённых с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс , Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa .
Основные принципы культивирования
Выделение клеток
Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов , как коллагеназа , трипсин , проназа , разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей и материалов.
Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определённого количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.
Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .
Культивирование клеток
Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование заражённых ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .
Перекрёстное загрязнение клеточных линий
При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.
Особенности выращивания клеток
При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:
- Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
- Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
- Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл , рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
- По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .
Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).
Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удалённых с их согласия .
Гибридома
Использование клеточных культур
Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии .
Продукты биотехнологии
Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины , противоопухолевые препараты . Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .
Тканевые культуры
Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .
Вакцины
С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого штаммом вируса H5N1 , в настоящий момент правительство Соединённых Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.
Культуры клеток не млекопитающих
Культуры клеток растений
Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определённого баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов .
Бактериальные, дрожжевые культуры
Основная статья: Бактериальная культура
Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара . Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).