ВходИммунология. Реакция преципитации. Её модификации
Cтраница 1
Реакция преципитации (РП) отличается от реакции агглютинации размером частиц антигена и видом образующегося феномена.
Реакция преципитации происходит в два этапа, во время которых реагирующие молекулы антигена и антител связываются друг с другом без каких-либо заметных изменений своей исходной химической структуры. Связывание антигена с антителами специфично, причем эта реакция частично или полностью обратима.
Реакция преципитации происходит вскоре после смешивания растворов антигена и иммунной сыворотки.
Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора АГ (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) в растворе электролита.
Для реакции преципитации необходимо оптимальное соотношение концентраций антигена и антител. В избытке антигена преципитат частично или полностью растворяется; в результате бывает невозможно оценить реакцию или же эта оценка может быть ошибочной. В то время как преципитаты, образованные кроличьими антителами, растворяются только при избытке антигена, преципитаты, образованные антителами лошади, часто могут растворяться в избытке как антигена, так и антител.
Для реакции преципитации оптимальными являются те значения температуры, рН и ионной силы среды, которые существуют в организме. Ход реакции преципитации зависит от ионной силы раствора: с увеличением концентрации соли выше 0 15 М постепенно замедляется образование преципитата. В то же время рН среды в довольно широком диапазоне, от 6 5 до 8 6, не влияет на реакцию преципитации.
Для реакции преципитации необходимо иметь специфические антисыворотки достаточно высокого титра.
Если реакция преципитации происходит в зоне эквивалентности, то, определив азот преципитата, можно вычислить соотношение реагирующих компонентов.
Этих недостатков лишена реакция преципитации в геле.
На первом этапе реакции преципитации происходит связывание молекул антигена с антителами, но видимых преципитатов не образуется. На втором этапе реакции происходит агрегация возникших ранее комплексов антиген - антитело с образованием больших нерастворимых частиц, видимых невооруженным глазом. Первый этап реакции протекает быстрее, более обратим и специфичен, чем второй.
Для экспресс-диагностики используют реакцию иммунной преципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими антителами. Готовят 2 % - ю суспензию фекалий, центрифугируют и пропускают ее через фильтр с диаметром пор 1 2 мкм. Суспензию (0 2 мл) смешивают с 0 2 мл разведенной иммунной сыворотки, выдерживают смесь 1 ч при 37 С и центрифугируют 1 ч при 12000 об / мин. Осадок ресуспензируют в 0 2 мл фосфатного буфера и добавляют 0 2 мл флюоресцирующего иммуноглобулина. После инкубации в течение 10 мин смесь центрифугируют 10 мин при 2000 об / мин, осадок ресуспензируют в фосфатном буфере, наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под иммерсионным объективом в люминесцентном микроскопе.
Иммунохимические методы, основанные на реакции преципитации, очень удобны для качественного и количественного анализа белков, для определения гомогенности белковых препаратов и наличия в них примесей, а также для идентификации компонентов белковых смесей. Как вспомогательный метод реакция преципитации применяется для изучения структуры белка. Преимущество этого метода по сравнению с другими состоит в том, что он может быть использован тогда, когда нельзя провести количественный химический анализ, например при определении данного компонента в смеси белков. Именно в этих случаях результаты, полученные с помощью иммунохимических реакций, могут быть очень полезны.
При исследовании разложившихся трупов грызунов применяют реакцию преципитации, так как выделить чистую культуру бактерий в этом случае трудно.
Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза с реакцией преципитации. Сначала проводят электрофорез белков в тонком слое геля.
Реакция преципитации.
| Наименование параметра | Значение |
| Тема статьи: | Реакция преципитации. |
| Рубрика (тематическая категория) | Образование |
Реакция преципитации (РП)- ϶ᴛᴏ осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).
РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе . В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.
Компоненты реакции преципитации.
1. Антиген (преципитиноген) -
это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены - ϶ᴛᴏ различные лизаты или экстракты тканей и др.
Размещено на реф.рф
Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген
имеет размеры клеток
(это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена
соизмеримы с размерами молекул
(это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.
2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.
3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.
Получение преципитиногена .
Получаютпутемизмельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.
Примеры преципитиногенов : лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор , в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.
Получение преципитирующих сывороток.
Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.
Примеры преципитирующих сывороток : преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.
Титр преципитирующей сыворотки - ϶ᴛᴏ наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.
Способы постановки РП.
1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Далее осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.
Учёт результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.
В случае если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция принято называть реакцией термокольцепреципитации (к примеру, при диагностике сибирской язвы).
2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:
а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии : один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата ;
б) метод двойной иммунодиффузии : и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации .
Примером РП в геле являетсяреакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии
Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (к примеру, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. В случае если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации .
Реакция преципитации. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Реакция преципитации." 2017, 2018.
Реакция преципитации
- РП (от
лат. praeci- pito
- осаждать,) - это формирование и осаж-дение комплекса растворимого молекулярно-го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк-вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца - преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.
Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита-тельных средах и др. Широкое распростране-ние получили разновидности реакции преци-питации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др
Реакция радиальной иммунодиффузии . Иммун-ную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застыва-ния в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диф-фундируя в гель, образует с антителами кольце- зые зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют лля определения содержания в крови иммуног-лобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет-ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят иммунную сыворотку, антитела кото-рой, диффундируя в гель, образуют в месте — встречи» с антигеном линии преципитации.
Иммунная электронная микроскопия - элек-тронная микроскопия микробов, чаще ви-русов, обработанных соответствующими ан-тителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов обра-зуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.
123. Реакция преципитации в геле для определения токсигенности микроорганизмов, механизм, методы постановки.
Реакция преципитации (РП) — это формирова-ние и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количес-твах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой - антиген - наслаивается на первый в виде раствора.
Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций.
Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1%-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки, 4-5 - по окружности на расстоянии 1-2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические - раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре.
Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где со-здаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных.
Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения.
Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.
Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита.
Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых коли-чествах, которые не обнаруживаются химическим путем.
Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические час-тицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бакте-риальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению.
В РП используются жидкие прозрачные Аг.
Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.
Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг.
Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикаль-но. При положительной реакции в пробирке на границе между сыворот-кой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появля-ется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг.
Она нашла также применение в су-дебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фаль-сификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Не-достатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формиро-вании преципитата.
Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля.
В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном рассто-янии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы.
При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных пере-крещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ.
Широко используется для диагностики заболева-ний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.
3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару-жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч-ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай-шим микроорганизмам.
РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ.
Реакция преципитации.
Для этого эритроциты обрабаты-вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей.
Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро-цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.
Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу-говицы»
Похожая информация:
Поиск на сайте:
Реакция кольцепреципитации
Реакция кольцеприцепитации – одна из наиболее простых серологических методов. Она выполняется в узких преципитационных пробирках. Сначала во все пробирки поровну разливают прозрачный раствор антигена, взятого в нескольких разведениях (1:2; 1:4; 1:8; 1:16).
Соединение антигенов и антител происходит на границе соприкосновения реагентов. В результате этого взаимодействия в положительных случаях (когда антиген соответствует антителу) через некоторое время происходит образование преципитата в виде опалесцирующего кольца.
Реакция нашла широкое применение в медицинской практике для выявления в шерсти, шкурах, мясе животных сибиреязвенного антигена (реакция Асколи); для обнаружения других возбудителей инфекционных болезней в патологическом материале, полученном от больных, или в объектах внешней среды, а также в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка в частности, белка крови или других биологических жидкостей.
Иммунодиффузия по Оухтерлони
Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле.
Метод основан на том, что частицы антигенов и антител из-за различных размеров диффундируют в геле с неодинаковой скоростью и вследствие этого продвигаются на разные расстояния. Это позволяет разделить отдельные системы антигенов в тех случаях, когда они находятся в смеси, и, следовательно, дает возможность изучить антигенную структуру бактерий и сложных белковых веществ, сывороток и тканей животных.
Наглядный и эффективный метод преципитации в геле предложил Оухтерлони.
На чашках Петри с агаром делают небольшие лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. В один из них наливают антиген, в другие — сыворотки. Компоненты реакции диффундируют в геле по направлению друг к другу и образуют видимую линию преципитации там, где антигены встречаются с оптимальными концентрациями специфических для него антител. Поскольку реагенты диффундируют из лунок концентрически, можно провести сразу несколько исследований, если разместить вокруг лунки с антителами несколько лунок с разными антигенами (или с разными разведениями одного и того же антигена).
Реакция Оухтерлони дает возможность делать заключение о природе антигена по известной сыворотке и, наоборот, по известному антигену определяется природа антител.
Преимущество метода – в том, что он позволяет сравнить антигенные компоненты сложных смесей и судить об их общности или различиях. Для сравнения общности антигенов готовят агар с лунками: в одну наливают антисыворотку, в другие – сравниваемые антигены. Если антигены различны, то полосы преципитации располагаются неодинаково.
Иммуноэлектрофорез
В последние годы для тонких иммунологических исследований применяется метод иммуноэлектрофореза. Метод впервые описали П.
Грабар и К. А. Уильямс в 1953 г. Он представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле на стеклянных пластинках с иммунодиффузией. В начале проводится электрофоретическое разделение антигена, зачастую представляющего собой смесь белковых или других молекул. Для этого антиген вносят в заранее вырезанную в агаре лунку, и пластинку с агаром на некоторое время помещают в зону постоянного электрического тока.
Из-за разной скорости движения молекул происходит разделение антигена на составляющие части. После этого в канавку, вырезанную в направлении, параллельном движению тока, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.
Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу.
Преципитация
Каждый антиген дает зону преципитации в виде дуги с соответствующими для него антителами. Число, положение и форма этих линий дают представление о составе исходной смеси антигена.
Реакция флоккуляции
Метод предложен Рамоном в 1924 году.
Он основан на том, что смесь токсина с антитоксической сывороткой в определенных условиях дает помутнение и выпадение осадка. При этом реакция наступает раньше в тех пробирках, где количество антитоксина соответствует дозе, полностью нейтрализующей данное количество токсина.
Следовательно, если известна сила токсина, то можно установить количество антитоксина в неизвестной испытуемой сыворотке. Для этого готовят несколько разведений исследуемой сыворотки, добавляют к каждому разведению одинаковые количества известного токсина, после чего наблюдают, в какой из пробирок раньше всего наступит флоккуляция (помутнение раствора). Определяют инициальную флоккуляцию. Затем производиться расчет.
Например, требуется определить концентрацию противодифтерийных антител в исследуемой сыворотке. В реакции применяется дифтерийный токсин, содержащий 50 Lf в 1 мл (Lf – это минимальное количество токсина, которое нейтрализуется 1 антитоксической единицей (АЕ) антисыворотки.
Допустим, что инициальная флоккуляция отмечена в пробирке, где находилось 0,2 мл этой сыворотки и 2 мл известного токсина активностью 100 Lf (50 Lf х 2).
Значит, 0,2 мл сыворотки нейтрализовали этот токсин. Следовательно, 0,2 мл сыворотки содержат 100АЕ, а в 1 мл этой сыворотки концентрация антител соответствует 500 АЕ (100 АЕ х 5).
Аналогичным методом реакцию флоккуляции можно применять и с противоположной целью – для определения иммунизирующих свойств анатоксинов.
Для этого необходима стандартная антитоксическая сыворотка.
Реакция нейтрализации
Реакция применяется при диагностике пищевых бактериальных отравлениях для определения в исследуемом материале бактериальных токсинов. Кроме того, ее можно ставить при исследовании некоторых объектов внешней среды на содержание патогенных бактерий, продуцирующих токсины, например, при исследовании почвы на наличие возбудителей столбняка или газовой гангрены.
Известно, что токсин в смеси с гомологической антитоксической сывороткой не проявляет своего токсического действия, так как токсин нейтрализуется. Реакция взаимодействия токсина с антитоксином, как правило, строго специфична, поэтому для постановки реакции нейтрализации с целью определения типа токсина необходимо иметь диагностические сыворотки, специфические к каждому виду и типу токсина. Можно применять одновременно применять смесь 2-3 антитоксических сывороток и более, если предполагается наличие в исследуемом материале несколько токсинов.
Реакция нейтрализации позволяет определить вид и тип токсина возбудителя.
Исследуемым материалом может быть фильтрат пищевых продуктов, предположительно вызвавших отравление, смывы с посуды, где находились эти продукты и др.
Предварительно проводится нейтрализация предполагаемого токсина. Для этого в пробирку с исследуемым материалом (опытная пробирка) добавляется антитоксическая диагностическая сыворотка (она содержит антитела к искомому токсину); в другую пробирку (контрольную) доливается равный объем физиологического раствора.
После кратковременной инкубации содержимое пробирок вводится двум группам белых мышей (опытной и контрольной).
Результаты реакции нейтрализации учитывают сразу же после гибели контрольных животных. В таком случае факт выживания животных, получивших антитоксическую сыворотку вместе с исследуемым материалом, указывает на наличие в нем токсина, соответствующего вводимой сыворотке.
Достоинством реакции нейтрализации является высокая достоверность получаемых результатов.
Однако по своей чувствительности и быстроте получения ответа она уступает некоторым другим методам исследования.
Реакции лизиса
Реакциями лизиса принято называть растворение корпускулярных антигенов под действием антител, специфичных в отношении данного антигена, в присутствии комплемента.
Из иммунных реакций, основанных на феномене лизиса бактерий и других корпускулярных антигенов, применяются, главным образом, реакции бактериолиза и гемолиза.
Реакция бактериолиза
Реакция происходит как in vitro, так и in vivo. Последняя известна под названием реакции В.И. Исаева – Пфейффера.
Этими учеными показано, что если морских свинок предварительно проиммунизировать холерными антигенами, то последующее введение им в брюшную полость высоковирулентной культуры холерного вибриона не вызывает заражения животных, так как в брюшной полости происходит растворение возбудителя под воздействием специфических антител.
В дальнейшем И.
И. Мечников доказал, что аналогичное растворение холерного вибриона под воздействием иммунной сыворотки происходит и в пробирке, если к основным компонентам добавить свежую сыворотку — источник компле-мента. Растворение бактерий под действием специфических антител в присутствии комплемента получило название реакции бактериолиза.
При постановке реакции бактериолиза сначала готовят ряд 10-кратных разведений исследуемой сыворотки. Затем в каждуюпробирку добавляют одинаковое количество (по 1-2 капли)микробной взвеси. К смеси добавляют комплемент. После инкубирования при 37 °С из каждой пробирки делается высев смеси на питательную среду для установления наличия или отсутствия жизнеспособных бактерий.
Реакцию можно применять для определения антител с помощью известного микроорганизма или для определения вида микробов с помощью диагностической иммунной сыворотки.
В практической работе бак-териологов эта реакция применяется редко, главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.
Реакция гемолиза
Механизм гемолиза аналогичен механизму бактериолиза.
Испо-льзуемые в реакции эритроциты являются антигеном. Источником ан-тител является антиэритроцитарная сыворотка (например, если в реакции применяются бараньи эритроциты, то необходимую сыворотку со специфическими антиэритроцитарными антителами получают от кро-ликов, иммунизированных бараньими эритроцитами).
В качестве комплемента в реакциях лизиса чаще всего используется сыворотка крови морской свинки, так как в ней содержится значительно больше комплемента, чем в сыворотках других животных.
В тех случаях, когда антитела в присутствии комплемента разрушают эритроциты, из них выходит гемоглобин, и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов превращается в прозрачную красную жидкость (лаковая кровь).
Такую реакцию называют гемолизом. В лабораторной практике она применяется в качестве пока-зателя адсорбции комплемента в реакции связывания комплемента.
Похожая информация:
Поиск на сайте:
План лекции: Предмет и краткая история развития микробиологии. Общие свойства микроорганизмов и их положение в природе.
преципитации реакция
Ветеринарная микробиология и ее задачи
mir.zavantag.com > Биология > Лекция
1 … 7 8 9 10 11 12 13 14 15
| ^
РА впервые разработана М.Грубером в 1896 г. Сущность реакции заключается во взаимодействии антитела с антигеном, в результате чего происходит склеивание (агглютинация) микробов с образованием хлопьев, комочков, видимых невооруженным глазом. РА широко применяется для серологической диагностики многих бактериальных инфекций (бруцеллеза, сапа, сальмонеллезов, колибактериоза и др.) и для серологической идентификации видов и типов выделенных микроорганизмов. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровекапельный, кольцевая реакция с молоком, реакция гемагглютинации и ее варианты (РЗГА, РНГА), антиглобулиновый тест Кумбса и др. ^ – вместо сыворотки берется кровь. Ставят пластинчатую реакцию. Диагностируют пуллороз кур и индеек, микоплазмоз кур. Реакция Кумбс�� позволяет выявить неполные антитела. Последние одновалентны, в связи с чем они тормозят образование агглютината. Метод основан на применении антиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). ^ – она не относится к серологическим и диагностически точным реакциям, однако позволяет обнаружить антиген – гемагглютинин и установить гемагглютинирующие свойства (способность агглютинировать эритроциты) у некоторых бактерий и микоплазм. РНГА – в последние годы заняла одно из ведущих мест в серодинамике. Сущность ее заключается в том, что белковые молекулы антигена соответствующего возбудителя или антитела предварительно адсорбируют на обработанных танином эритроцитов барана или др. животного. Затем ставят реакцию путем смешивания сенсибилизированных эритроцитов с сыворотками крови больных животных или во втором случае с исследуемым антигеном. При наличии в сыворотке спец. Антител на данный антиген (или наоборот) происходит агглютинация эритроцитов – реакция положительная. Предложена Р.Краусом в 1897 году. Преципитация – явление, наблюдающееся при взаимодействии антител-преципитинов и антигена-преципитиногена. Сущность реакции заключается в изменении дисперсности коллоидов антигена и их осаждением под влиянием специфических антител, находящихся в иммунной сыворотке. РП может быть поставлена в пробирках в жидкой среде (реакция кольцеприципитации) или в агаровом геле (пластинчатая РДП). Реакция кольцеприципитации впервые предложена Асколи (1910), наиболее широко ее применяют в целях диагностики сибирской язвы. При проведении ветеринарной экспертизы РП является методом определения фальсификации мясных, мучных и др. продуктов. Особое значение эта реакция имеет в судебно-медицинской экспертизе при определении видовой принадлежности крови. Применение реакции преципитации в жидкой среде не позволяет, однако, охарактеризовать гетерогенность антигенов, т.е. количество и концентрацию антигенов в препарате. Данные сведения можно получить, если поставить РП в геле (чаще агаровом). Обладая скоростью передвижения, различные антигены препарата неодинаково диффундируют, образуя в толще прозрачного геля не месте встречи с гомологичным антителом преципитаты. Локализация и концентрация линий преципитинов будут характерны для каждого компонента антигенного препарата, что служит критерием его качества. Путем разведения препарата можно характеризовать относительное содержание в нем антигенов. Разработано несколько методов постановки РДП: метод прямой одномерной диффузии по Удену (1946), метод простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (1963), метод двойной диффузии в агаровый гель по Оухтерлони (1948) и др. ^
(РН) на модели столбнячных токсинов и антитоксинов. Сущность РН заключается в способности гомологичных антител иммунной сыворотки подавлять (нейтрализовать) инфекционные свойства возбудителя болезни или продуктов его жизнедеятельности. Для установления результата реакции смесью антиген-антитело заражают лабораторных животных, КК, КЭ. Показатель положительно РН – отсутствие гибели биологических тест-систем. В бактериальной практике РН применяют при диагностике анаэробной энтеротоксемии, ботулизма и др. РН проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов. Используют для выявления антител в сыворотке крови и для обнаружения в исследуемом материале антигена (при бруцеллезе, сапе, риккетсиозах, туберкулезе и др.). Данная реакция относится к непрямой двухсистемной. В ней участвуют 5 компонентов:
Компоненты 3,4,5 составляют индикаторную систему. Если антиген и антитело испытуемой сыворотки соответствуют друг другу, возникает иммунный комплекс антиген-антитело, который связывает и извлекает из среды, где протекает реакция, комплемент. При отсутствии в испытуемой сыворотке антител, соответственных антигену, указанный комплекс не образуется – комплемент остается свободным. Поскольку это невидимые процессы, то для решения вопроса, что же произошло с комплементом, в пробирку в качестве индикатора вводят компоненты гемолитической системы – гемолитическую сыворотку + эритроциты. Если в бактериологической системе комплемент связался – гемолиз эритроцитов не произойдет, результат положительный – в сыворотке содержатся антитела. Наличие гемолиза служит показателем наличия свободного комплемента в бактериологической системе, что возможно только при отсутствии в испытуемой сыворотке антител – результат отрицательный. РСК протекает при строгих количественных соотношениях компонентов. Это достигается их предварительным титрованием (комплемент и гемолитическую сыворотку титруют в день постановки реакции; микробный антиген – один раз в течение 2-3 месяцев). Титрование – определение наименьшего количества того или иного компонента в реакции для проведения реакции, лишнее или недостаток – искажение результатов. РДСК – это вариант РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16-18 часов на холоде (40С), что повышает чувствительность из-за более длительной адсорбции комплемента комплексом антиген-антитело. |
7 8 9 10 11 12 13 14 15
Схожі:
| Определение понятия «экологическая микробиология» Общей микробиологии, изучающий взаимоотношения микроорганизмов между собой, с объектами внешней среды и макроорганизмом |
Наиболее общие и фундаментальные понятия, отражающие существенные,… Философия -наука, к-рая изучает самые общие положения о человеке, природе и о познании |
||
| План Предмет и метод дисциплины «Международные экономические отношения»… Предмет и метод дисциплины «Международные экономические отношения» и история развития мэо |
Вопросы к экзамену по курсу «юридическая психология» Для студентов… Понятие о юридической психологии. Предмет, задачи и история развития юридической психологии |
||
| 1. Предмет и метод истории политических и правовых учений > Предмет… Это обусловлено тем, что в рамках данной юридической дисциплины исследуется и освещается специфический предмет – история возникновения… |
1.
История философии как наука. Её предмет и метод |
||
| Министерство образования и науки республики казахстан альянс студентов… Настоящее положение о республиканском конкурсе «Студент Года- 2011» (далее по контексту конкурс) определяет его цели и задачи, участников… |
Определение терминов «микробиология» и«микроорганизм» … |
||
| Вопросы для подготовки к зачету по дисциплине «конфликтология» Конфликтология как наука: предмет, цели, задачи, актуальные проблемы, значение на современном этапе развития общества |
О краевом конкурсе видео-роликов «к-роли-к!» Общие положения Настоящее Положение определяет цели, задачи, принципы Конкурса, порядок его организации и проведения, порядок участия и определения… |
Додайте кнопку на своєму сайті:
Школьные материалы
mir.zavantag.com
Реакция преципитации
Преципитация и агглютинация - это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ.
В первом случае он представлен в растворимой, во втором - в корпускулярной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ-АТ. РП высоко специфична и чувствительна.
Ингредиенты реакции:
1. растворимый АГ или гаптен (преципититоген);
2. АТ - преципитины {иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими растворами АГ-ми);
Реакция преципитации
изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.
Методы постановки РП:
1) РП в растворах - р.
кольцепреципитации;
2) РП в геле.
Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки.
Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации.Примером такого способа постановки РП является реакция термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильного гаптена возбудителя сибирской язвы, извлекаемый из органов животных, кожи, шерсти экстракцией при кипячении.Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки.
В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.Реакция преципитации в геле носит название иммунодиф-фузии.
Часто форезом в геле - иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофорети-чески. полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки.
Реакция Асколи ставится для диагностики сибирской язвы с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген - гаптен B.
Antrachis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
Приготовление термопреципитиногена.
1. 8 колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры В. ап1Ьгас!3, налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Просрильтровать через асбестную эату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.
Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитэционную пробирку наливается 0,3 мл пре-ципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципи-тиноген- Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут.
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ.
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.
Реакция преципитации (РП)
Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 1). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.
Рис. 1. Реакция преципитации:1 - антиген; 2 - антитело.
Реакция преципитации в геле по Оухтерлони. Для постановки реакции используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 2).
Рис. 2. Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации; Б - реакция преципитации по Оухтерлони.
Реакция кольцепреципитации
Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1- 0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 2). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител.
Радиальная иммунодиффузия по Манчини
Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка. Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 3). Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 3).
Рис. 3. Простая радиальная иммунодиффузия:а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая.
Реакция иммуноэлектрофореза (ИЭФ)
В основе реакции лежит принцип преципитации. ИЭФ, как правило, используется для исследования антигенной структуры микроорганизмов. Реакцию проводят в два этапа. Вначале проводят электрофоретическое разделение антигена в забуференном агаровом геле. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. Затем через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. После этого в канавку, которая расположена по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются дугообразные линии преципитации. С помощью ИЭФ анализируются состав и количество белков сыворотки крови, спиномозговой жидкости, микробных протеинов (рис. 4).
Рис. 4. Реакция иммуноэлектрофореза.
В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца - преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.
Реакция преципитации является очень чувствительным методом и ее применяют при исследовании различных белковых и полисахаридных антигенов в судебно- медицинской практике для определения видовой принадлежности пятен крови, спермы, сыворотки, имеющихся на белье и различных предметах. Эту реакцию можно также использовать для выявления различных примесей к молоку, рыбным и мясным продуктам, определения природы белков, входящих в краски старинных мастеров живописи.